Descoperire crucială. Oamenii de știință au aflat cum infectează coronavirusul celulele și cum se ascunde de sistemul imunitar

Coronavirusul este îmbrăcat într-un strat bogat de zahăr. Proteinele spike ale SARS-CoV-2 sunt îmbrăcate în molecule de zahăr, cunoscute sub numele de glicani, relatează oamenii de știință.

Cum infectează coronavirusul celulele și ce trucuri folosește pentru a se camufla

„Când o vezi cu toți glicanii, este aproape de nerecunoscut”, spune Rommie Amaro, chimist biofizic de calcul de la Universitatea din California, San Diego, citată de revista Nature.

Mulți viruși au glicani care își acoperă proteinele exterioare, camuflându-i în fața sistemului imunitar uman. Dar anul trecut, Amaro și colaboratorii săi au creat cea mai detaliată vizualizare a acestui strat, pe baza datelor structurale și genetice și redate atom cu atom de către un supercomputer.

Pe 22 martie 2020, ea a postat simularea pe Twitter.

Într-o oră, un cercetător a întrebat într-un comentariu: ce era bucla goală, neacoperită, care ieșea din vârful proteinei? Amaro habar n-avea. Dar zece minute mai târziu, biologul structural Jason McLellan de la Universitatea Texas din Austin a intervenit: bucla neacoperită era un domeniu de legare a receptorilor (RBD), una dintre cele trei secțiuni ale proteinei spike care se leagă de receptorii de pe celulele umane.

Digi24.ro

Niște români s-au instalat confortabil în casa unei spaniole plecate la copii, în Canada, și nu mai vor să plece

În simularea lui Amaro, când RBD s-a ridicat deasupra norului de glicani, doi dintre aceștia au intervenit pentru a-l bloca în loc. Când Amaro a mutat glicanii din modelul computerului, RBD s-a prăbușit.

Echipa lui McLellan a construit o modalitate de a încerca același experiment în laborator și, până în iunie 2020, aceștia au raportat că mutarea celor doi glicani a redus capacitatea proteinei spike de a se lega de un receptor din celulele umane – un rol pe care nimeni l-a recunoscut anterior la coronavirusuri, spune McLellan.

Este posibil ca îndepărtarea acestor două zaharuri să reducă infecțiozitatea virusului, spune Amaro, deși cercetătorii nu au încă o modalitate de a face acest lucru.

Oamenii de știință caută modalități de a întrerupe procesul de infectare a celulelor

De la începutul pandemiei de COVID-19, oamenii de știință au dezvoltat o înțelegere detaliată a modului în care SARS-CoV-2 infectează celulele. Prin separarea procesului de infecție, ei speră să găsească modalități mai bune de a-l întrerupe prin tratamente și vaccinuri îmbunătățite și să afle de ce cele mai recente tulpini, cum ar fi varianta Delta, sunt mai transmisibile.

Digisport.ro

Arpad Paszkany s-a afișat cu noua iubită, cu 24 de ani mai tânără, iar acum s-a aflat totul: femeia a rupt tăcerea

Ceea ce a apărut în urma a 19 luni de muncă, susținută de decenii de cercetare a coronavirusului, este o relatare explozivă a modului în care SARS-CoV-2 invadează celulele umane. Oamenii de știință au descoperit adaptări cheie care ajută virusul să se prindă de celulele umane cu o forță surprinzătoare și apoi să se ascundă odată înăuntru.

Mai târziu, pe măsură ce părăsește celulele, SARS-CoV-2 execută o etapă crucială de procesare pentru a-și pregăti particulele pentru a infecta și mai multe celule umane. Acestea sunt câteva dintre instrumentele care au permis virusului să se răspândească atât de repede și să afecteze milioane de vieți.

„De aceea este atât de dificil de controlat”, spune Wendy Barclay, virolog la Imperial College London.

Fiecare virion SARS-CoV-2 (particulă de virus) are o suprafață exterioară presărată cu 24-40 de proteine ​​spike dispuse la întâmplare, care sunt cheia pentru fuzionarea cu celulele umane.

Pentru alte tipuri de virus, cum ar fi gripa, proteinele de fuziune externe sunt relativ rigide. Cu toate acestea, proteinele spike ale SARS-CoV-2 sunt extrem de flexibile și sunt articulate în trei puncte, conform lucrării publicate în august 2020 de biochimistul Martin Beck de la Institutul de biofizică Max Planck din Frankfurt, Germania și colegii săi.

Acest lucru permite acestora să se învârtă, să se legene și să se rotească, ceea ce le-ar putea facilita scanarea suprafeței celulei și legarea mai multor vârfuri de o celulă umană. Nu există date experimentale similare pentru alte coronavirusuri, dar pentru că secvențele proteinei spike ​​sunt extrem de conservate din punct de vedere evolutiv, este corect să presupunem că trăsătura este comună, spune Beck.

La începutul pandemiei, cercetătorii au confirmat că RBD-urile proteinelor SARS-CoV-2 se atașează la o proteină familiară numită receptor ACE2, care împodobește exteriorul majorității celulelor umane ale gâtului și plămânilor.

Acest receptor este, de asemenea, punctul de andocare pentru SARS-CoV, virusul care cauzează sindromul respirator acut sever (SARS). Dar, comparativ cu SARS-CoV, SARS-CoV-2 se leagă la ACE2 de aproximativ 2-4 ori mai puternic, deoarece mai multe modificări ale RBD stabilizează punctele de legare a virusului.

Variantele îngrijorătoare ale SARS-CoV-2 tind să aibă mutații în subunitatea S1 a proteinei spike, care găzduiește RBD și este responsabilă de legarea la receptorul ACE2. O a doua subunitate de vârf, S2, determină fuziunea virală cu membrana celulei gazdă.

Varianta Alfa, de exemplu, include zece modificări în secvența proteinei spike, ceea ce are ca rezultat ca RBD-urile să rămână în poziția „sus”. „Ajută virusul de-a lungul timpului, facilitând pătrunderea în celule”, spune Priyamvada Acharya, biolog structural la Institutul Duke Human Vaccine din Durham, Carolina de Nord, care studiază mutațiile vârfurilor.

Varianta Delta, care se răspândește acum în întreaga lume, găzduiește mutații multiple în subunitatea S1, inclusiv trei în RBD care par să îmbunătățească capacitatea RBD de a se lega de ACE2 și de a se sustrage sistemului imunitar.

Cum pătrunde SARS-CoV-2 în celulele umane

Odată ce vârfurile virale se leagă de ACE2, alte proteine ​​de pe suprafața celulei gazdă inițiază un proces care duce la îmbinarea membranelor virale și celulare).

Virusul care cauzează SARS, SARS-CoV, folosește oricare dintre cele două proteaze ale celulei gazdă pentru a pătrunde: TMPRSS2 sau catepsina L.

TMPRSS2 este calea mai rapidă, dar SARS-CoV intră adesea printr-un endozom – o bulă înconjurată de lipide – care se bazează pe catepsină L. Când virionii pătrund în celule pe această cale, cu toate acestea, proteinele antivirale le pot prinde.

SARS-CoV-2 diferă de SARS-CoV deoarece folosește eficient TMPRSS2, o enzimă care se găsește în cantități mari pe exteriorul celulelor respiratorii. În primul rând, TMPRSS2 taie un site pe subunitatea S2 a vârfului.

Această tăietură expune o serie de aminoacizi hidrofobi care se îngropă rapid în membrana cea mai apropiată – cea a celulei gazdă. Apoi, vârful extins se pliază înapoi pe sine, ca un fermoar, forțând membranele virale și celulare să se contopească.

Virusul își livrează apoi genomul direct în celulă. Invadând în această manieră, SARS-CoV-2 infectează mai repede decât SARS-CoV și evită să fie prins în endozomi, potrivit lucrării publicate în aprilie de Barclay și colegii ei de la Imperial College London.

Intrarea rapidă a virusului folosind TMPRSS2 explică de ce medicamentul pentru malarie clorochină nu a funcționat în studiile clinice ca tratament COVID-19, în ciuda studiilor promițătoare timpurii din laborator.

S-a dovedit că au folosit celule care se bazează exclusiv pe catepsine pentru intrarea endozomală. „Când virusul se transmite și se reproduce pe căile respiratorii umane, acesta nu folosește endozomi, astfel încât clorochina, care este un medicament care perturbă endozomul, nu este eficientă în viața reală”, spune Barclay.

Descoperirea indică, de asemenea, inhibitorii de protează ca o opțiune terapeutică promițătoare pentru a preveni un virus de la utilizarea TMPRSS2, catepsina L sau alte proteaze pentru a intra în celulele gazdă.

Un inhibitor TMPRSS2, mesostat de camostat, care este aprobat în Japonia pentru tratarea pancreatitei, a blocat intrarea virală în celulele pulmonare, dar medicamentul nu a îmbunătățit rezultatele pacienților într-un studiu clinic inițial.

„Din perspectiva mea, ar trebui să avem astfel de inhibitori de protează ca antivirale de spectru larg disponibile pentru a combate noile focare de boală și pentru a preveni pandemiile viitoare chiar de la început”, spune Stefan Pöhlmann, directorul Unității de biologie a infecțiilor la Centrul German pentru Primate din Göttingen, care are a condus cercetări privind legarea ACE2 și calea TMPRSS2.

SARS-CoV-2 își elimină rapid concurența

Următorii pași de infecție sunt mai tulburi. „Există mult mai multe cutii negre după ce vă aflați în celulă”, spune chimistul Janet Iwasa de la Universitatea din Utah din Salt Lake City, care dezvoltă o animație adnotată a ciclului de viață viral. „Există mai multe incertitudini și ipoteze concurente”.

După ce virusul își livrează genomul ARN în celulă, ribozomii din citoplasmă traduc două secțiuni ale ARN-ului viral în șiruri lungi de aminoacizi, care sunt apoi tăiați în 16 proteine, inclusiv multe implicate în sinteza ARN.

Mai târziu, se generează mai multe ARN-uri care codifică un total de 26 de proteine ​​virale cunoscute, inclusiv cele structurale utilizate pentru a produce noi particule de virus, cum ar fi proteina spike și alte proteine ​​accesorii. În acest fel, virusul începe să producă copii ale propriului ARN messenger. Dar are nevoie de echipamentul celulei pentru a traduce aceste ARNm în proteine.

Coronavirusurile preiau acele mașini în multe feluri. Virusologul Noam Stern-Ginossar și echipa ei de la Weizmann Institute of Science din Rehovot, Israel, au detaliat trei mecanisme prin care SARS-CoV-2 suprimă traducerea ARNm-ului al celulei gazdă în favoarea sa. Niciunul nu este exclusiv acestui virus, dar combinația, viteza și amploarea efectelor par unice, spune Stern-Ginossar.

În primul rând, virusul elimină concurența: proteina virală Nsp1, una dintre primele proteine ​​traduse la sosirea virusului, recrutează proteine ​​gazdă pentru a tăia în mod sistematic toate ARNm-urile celulare care nu au etichetă virală. Când echipa lui Stern-Ginossar a pus aceeași etichetă la capătul unui ARNm gazdă, acesta nu a fost tăiat.

În al doilea rând, infecția reduce translația globală a proteinelor în celulă cu 70%. Nsp1 este din nou principalul vinovat, de data aceasta blocând fizic canalul de intrare al ribozomilor, astfel încât ARNm nu poate pătrunde în interior, conform lucrărilor a două echipe de cercetare. Capacitatea redusă de traducere care rămâne este dedicată ARN-urilor virale, spune Stern-Ginossar.

În cele din urmă, virusul oprește sistemul de alarmă al celulei. Acest lucru se întâmplă în numeroase moduri, dar echipa Stern-Ginossar a identificat un mecanism clar pentru SARS-CoV-2: virusul împiedică ieșirea ARNm-ului celular din nucleu, inclusiv instrucțiuni pentru proteine ​​menite să alerteze sistemul imunitar la infecție.

O a doua echipă a confirmat această descoperire și a indicat din nou spre Nsp1: proteina pare să blocheze canalele de ieșire din nucleu, astfel încât nimic nu poate scăpa.

Deoarece transcrierile genetice nu pot ieși din nucleu, celulele infectate nu eliberează mulți interferoni – acestea sunt proteine ​​de semnalizare care alertează sistemul imunitar de prezența unui virus.

SARS-Cov-2 este deosebit de eficient la închiderea acestui sistem de alarmă: comparativ cu alte virusuri respiratorii, inclusiv SARS-CoV și virusul sincițial respirator, infecția cu SARS-CoV-2 induce niveluri semnificativ mai mici de interferoni. Și în luna iunie a acestui an, cercetătorii au raportat mutații în varianta Alpha care par să îi permită să supună producția de interferon și mai eficient.

„Este clar că SARS-CoV-2 este un virus foarte rapid care are o capacitate unică de a împiedica sistemul nostru imunitar să recunoască și să combată infecția în primele etape”, spune Stern-Ginossar.

Până în momentul în care sistemul imunitar își dă seama că există un virus, există atât de mult din el, încât proteinele cu răspuns imun uneori inundă fluxul sanguin cu o viteză mai mare decât în mod normal – ceea ce poate provoca daune.

Medicii au văzut la începutul pandemiei că unele persoane cu COVID-19 care se îmbolnăvesc foarte mult sunt afectate de un răspuns imun hiperactiv la SARS-CoV-2, precum și de virusul în sine. Unele tratamente dovedite acționează prin reducerea acestui răspuns imunitar.

SARS-CoV-2 remodelează celulele gazdă în funcție de nevoile sale

Odată ce virusul a preluat traducerea gazdei, începe o remodelare pe larg a interiorului și exteriorului celulei în funcție de nevoile sale.

În primul rând, unele dintre noile proteine ​​virale spike călătoresc la suprafața celulei și ies din membrana celulei gazdă. Acolo, ele activează un canal gazdă de calciu-ion, care expulzează o strat grăsos pe exteriorul celulei – aceeași acoperire găsită pe celulele care se contopesc în mod natural, cum ar fi celulele musculare. În acest moment, celula infectată se fuzionează cu celulele vecine care exprimă ACE2, devenind celule respiratorii individuale masive pline cu până la 20 de nuclee.

Aceste structuri fuzionate, numite sinciții, sunt induse de infecții virale precum HIV și virusul herpes simplex, dar nu de virusul SARS, spune biologul molecular Mauro Giacca de la King’s College din Londra, care a condus echipa care a publicat concluzia în aprilie.

El presupune că formarea sincițiilor permite celulelor infectate să prospere pentru perioade lungi de timp, producând tot mai mulți virioni. „Acesta nu este un virus de tip hit-and-run”, spune el. „Persistă”.

O a doua echipă, condusă de cercetătorul Qiang Sun de la Academia Chineză de Științe Medicale din Beijing, a descoperit că unele celule infectate cu COVID-19 formează chiar sinciții cu limfocite – una dintre celulele imune ale corpului.

Acesta este un mecanism cunoscut de evaziune imună de către celulele tumorale, dar nu și de viruși. Aceasta sugerează că celulele infectate evită detectarea imunității prin simpla invadare și combinare cu cercetașii imuni din apropiere.

În interiorul celulei se produc și mai multe schimbări. Ca și alte coronavirusuri, SARS-CoV-2 transformă reticulul endoplasmatic lung, subțire (ER), o rețea de membrane plate implicate în sinteza și transportul proteinelor, în sfere cu membrană dublă.

Aceste vezicule cu membrană dublă (DMV) ar putea oferi un loc sigur pentru ca ARN-ul viral să fie reprodus și tradus, protejându-l de senzorii imuni înnăscuți din celulă, dar această ipoteză este încă investigată.

Proteinele implicate în fabricarea DMV-urilor ar putea fi ținte bune pentru medicamente, deoarece par a fi necesare pentru replicarea virală. De exemplu, o proteină gazdă, TMEM41B, este necesară pentru a mobiliza colesterolul și alte lipide pentru a extinde membranele ER, astfel încât toate părțile virusului să se potrivească în interior.

Proteina transmembranară coronavirus Nsp3 ar putea fi, de asemenea, o țintă: creează un por asemănător coroanei în pereții DMV-urilor pentru a transfera ARN viral nou creat.

Majoritatea virușilor care au un înveliș exterior, cunoscut sub numele de plic, formează această caracteristică prin asamblarea directă la marginea celulei, cooptând o parte din membrana plasmatică a celulei la ieșire. Însă proteinele coronavirus create recent iau o cale diferită.

De ani de zile, dovezile au sugerat că transportarea în afara celulei a coronavirusurilor se face prin complexul Golgi, un organit care funcționează ca o poștă, ambalând molecule în membrane și trimitându-le în alte părți ale celulei.

Acolo, virusul formează un înveliș lipidic din membrana complexului Golgi; virionii nou formați sunt apoi transportați în interiorul veziculelor Golgi la suprafața celulei, unde sunt eliminați din celulă, spune virusologul și biologul celular Carolyn Machamer de la Universitatea Johns Hopkins din Baltimore, Maryland, care a studiat coronavirusurile de 30 de ani.

Dar, în decembrie, biologul celular Nihal Altan-Bonnet de la Institutul Național al Inimii, Plămânilor și Sângelui din Bethesda, Maryland, și colegii ei au raportat că au detectat coronavirusuri care părăseau celula prin lizozomi – coșuri de gunoi celulare pline de enzime care descompun părți ale celulei.

Blocarea căii secretoare bazate pe Golgi nu pare să afecteze cantitatea de virus infecțios eliberat, spune Altan-Bonnet. Dovezile echipei sale sugerează că proteinele virale formează un înveliș prin înmugurire în ER, apoi preiau lizozomii pentru a ieși din celulă. Cercetătorii testează în prezent inhibitori care blochează procesul de ieșire lizozomală ca potențiali candidați antivirali.

Părăsirea unei celule prin Golgi sau lizozomi este lentă și ineficientă în comparație cu înmugurirea dintr-o membrană plasmatică, astfel încât oamenii de știință nu știu de ce o face SARS-CoV-2. Machamer suspectează că compoziția lipidică a unui înveliș derivat din Golgi sau lizozom este cumva mai benefică pentru virus decât una din membrana plasmatică.

“Dacă am înțelege această parte puțin mai bine, ar exista oportunități excelente pentru noi terapii antivirale”, spune ea.

Virusul se pregătește să infectee o nouă țintă

La ieșirea din celulă, încă un eveniment face ca acest virus să devină o instituție a infecțiozității: o tăietură rapidă într-un loc cu cinci aminoacizi pregătește virusul pentru a-și atinge următoarea țintă.

Dacă alte coronavirusuri au un singur aminoacid argininic la joncțiunea subunităților S1 și S2 ale vârfului, SARS-CoV-2 are o linie de cinci aminoacizi.

„Deoarece site-ul a fost neobișnuit, ne-am concentrat asupra acestuia și s-a dovedit că, da, site-ul este esențial pentru invazia celulelor pulmonare”, spune Pöhlmann.

În mai 2020, el și colegii săi au raportat că o proteină din celula gazdă numită furină recunoaște și taie șirul de aminoacizi – și tăierea este „esențială” pentru ca virusul să pătrundă eficient în celulele pulmonare umane.

Nu este prima dată când cercetătorii identifică un sit de scindare a furinei pe un virus; virusurile gripei aviare extrem de patogene o au, de asemenea, spune Barclay.

Când o colegă i-a trimis lui Barclay o tulpină de SARS-CoV-2 în cultură care a pierdut spontan locul de scindare a furinei, echipa sa a descoperit că dihorii infectați cu această tulpină au eliminat particule virale în cantități mai mici decât cei infectați cu tulpina pandemică și nu au transmis infecția animalelor din apropiere.

În același timp în care echipa lui Barclay și-a raportat rezultatele într-o preimprimare din septembrie 2020, un studiu din Olanda a constatat, de asemenea, că coronavirusul cu un sit de clivaj furinic intact pătrunde celulele căilor respiratorii umane mai repede decât cele fără el.

Furina este suspectată că taie situl la un moment dat în timpul asamblării virionului sau chiar înainte de eliberare. Momentul ar putea explica de ce virusul iese prin Golgi sau lizozomi, spune Tom Gallagher, virusolog la Universitatea Loyola Chicago din Illinois.

Prin tăierea legăturii dintre subunitățile S1 și S2, tăietura furinei slăbește proteinele virion spike, astfel încât în ​​timpul intrării celulelor să răspundă la o a doua tăietură de TMPRSS2, care expune zona hidrofobă care se îngropă rapid într-o membrană a celulei gazdă, spune Gallagher.

Dacă vârfurile nu sunt pre-tăiate de furină – și nu sunt întotdeauna – ocolesc TMPRSS2 și intră prin calea endozomală mai lentă, dacă este deloc.

Două variante de coronavirus, Alpha și Delta, au modificat siturile de scindare a furinei.

În varianta Alpha, aminoacidul prolin inițial este schimbat în histidină (P681H); în varianta Delta, se schimbă în arginină (P681R). Ambele modificări fac secvența mai puțin acidă și, cu cât șirul de aminoacizi este mai bazic, cu atât furina o recunoaște și o reduce, spune Barclay. „Am presupune că acesta este virusul care devine și mai bun la transmiterea acestuia”.

Mai multe tăieturi de furină înseamnă mai multe proteine ​​de vârf pregătite să intre în celulele umane. În SARS-CoV, mai puțin de 10% din proteinele spike sunt pregătite, spune Menachery, al cărui grup de laborator a cuantificat proteinele spike primate, dar încă nu a publicat această lucrare.

În SARS-CoV-2, acest procent crește la 50%. În varianta Alpha, este mai mult de 50%. În varianta Delta extrem de transmisibilă, grupul a descoperit că mai mult de 75% dintre vârfuri sunt pregătite pentru a infecta o celulă umană.

Necunoscute cheie

Comunitatea științifică încă este la suprafața înțelegerii sale despre SARS-CoV-2. Necunoscutele cheie includ numărul de receptori ACE2 necesari pentru a se lega de fiecare proteină spike, când exact site-ul S2 este scindat de TMPRSS2 și numărul de vârfuri necesare pentru fuziunea virus-membrană celulară și asta este doar pentru intrare.

În aprilie 2020, o echipă de la Universitatea din California, San Francisco, a identificat cel puțin 332 de interacțiuni între SARS-CoV-2 și proteinele umane.

Nu este ușor să ții pasul cu virusul care se mutează rapid. Majoritatea mutațiilor de până acum sunt asociate cu cât de eficient se răspândește virusul, nu cu cât de mult dăunează virusul gazdei, sunt de acord experții.

Luna aceasta, un studiu a raportat că varianta Delta a crescut mai rapid și la niveluri mai ridicate în interiorul plămânilor și gâtului oamenilor decât versiunile anterioare ale virusului.

Dar nu este încă sigur cum mutațiile Delta au supraalimentat varianta în acest fel, spune Stern-Ginossar. „Este ceva ce multe laboratoare încearcă să-și dea seama”.